□ 劉海琴 鶴壁市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心

　　磺胺類獸藥是畜禽抗感染治療中的重要藥物，經(jīng)過(guò)各種給藥途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，使用不合理很容易在動(dòng)物組織中造成殘留。近幾年來(lái)由于不科學(xué)和超量使用，殘留量也隨之加大，人們食用磺胺類藥物殘留超限量的畜禽產(chǎn)品，會(huì)出現(xiàn)急性或慢性中毒，影響人體的泌尿、免疫系統(tǒng)，破壞肌肉腎臟和甲狀腺等組織，如誘發(fā)人的甲狀腺癌等，還會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)很多細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。對(duì)磺胺類藥物殘留的檢測(cè)原理主要是動(dòng)物組織中磺胺類藥物經(jīng)乙腈振蕩提取后，用堿性氧化鋁小柱凈化，注入高效液相色譜儀反向色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積進(jìn)行比較，外標(biāo)法計(jì)算磺胺類藥物的含量。本文以豬肉樣品為例，談?wù)動(dòng)嘘P(guān)磺胺殘留檢測(cè)的一些問(wèn)題。

　　材料與方法

　　儀器與試劑

　　安捷倫1100液相色譜儀-配紫外，R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，VX-2渦旋振蕩器,3-30k高速冷凍離心機(jī)，固相萃取裝置，堿性氧化鋁SPE小柱，乙腈(色譜級(jí)),甲醇(色譜級(jí)),冰乙酸(分析純)，正己烷(分析純),無(wú)水硫酸鈉(分析純),SMM，SM2，SMZ，SDM，SQ標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99.7%(中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供)。

　　樣品前處理

　　試料制備與保存

　　從全部豬肉樣品中取出有代表性豬肉樣品約1kg，用勻漿機(jī)充分?jǐn)囁椋殖?份，分別裝入潔凈容器內(nèi)，密封成為試樣，標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃冷凍保存(臨用前解凍并恢復(fù)至室溫)。

　　提取溶劑、分離、凈化方式等

　　主要前處理過(guò)程

　　稱入樣品5.0g(精確至0.0001g)于具塞離心管中，加入5g無(wú)水硫酸鈉，加入15mL乙腈勻漿后，于渦旋震蕩器上4000r/min振蕩5min，5000r/min離心5min，上清液全部轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入20mL正已烷的離心管中，試料中再加入15mL乙腈重復(fù)提取一次，離心后的上清液一同轉(zhuǎn)移至離心管中，振搖、靜置分層。取下層液，加入正丙醇5mL，50℃減壓至近干。

　　堿性氧化鋁SPE柱臨用前用95%乙腈預(yù)洗，濃縮物用95%乙腈3mL溶解后過(guò)柱;再加95%乙腈5mL洗滌雞心瓶并將溶液過(guò)柱、擠干，棄去過(guò)柱液。用70%乙腈10mL洗脫，洗脫液收集到雞心瓶中，擠干，洗脫液加入5mL正丙醇，50℃減壓濃縮至干，濃縮物用2.0mL流動(dòng)相溶解，用微孔濾膜過(guò)濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)測(cè)定。

　　儀器設(shè)置

　　色譜條件：色譜柱：C18柱，250mm×4.6mmid;流動(dòng)相∶乙腈∶甲醇∶水∶乙酸(2∶2∶9∶0.2);流動(dòng)相流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm;進(jìn)樣量：20μL樣品一式兩份。

　　色譜分析：配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液與凈化后的樣品分別進(jìn)樣，以保留時(shí)間定性，以樣品溶液峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液面積比較外標(biāo)法定量。

　　結(jié)果

　　定性：樣品中未知組分的保留時(shí)間(Rt)分別與標(biāo)樣的保留時(shí)間(Rt)相比較，如果樣品中某組分的兩組保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)中某一藥物的兩組保留時(shí)間一致即可認(rèn)定為該藥物。

　　計(jì)算：樣品中被測(cè)獸藥殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì)，單位以毫克每千克(mg/kg)表示，按以下公式計(jì)算。

　　結(jié)果與討論

　　樣品加入乙腈后提取時(shí)間要充分，要將樣品中的磺胺類藥物溶解在乙腈試劑中，且樣品之間的提取時(shí)間盡可能一致，前者為提高回收率，后者為提高樣品之間的精密度，樣品提取液上柱(SPE柱)時(shí)，一定控制溶液流速，最好不大于10滴/min,如果流速過(guò)快,樣品中的磺胺類藥物不能夠完全吸附在SPE萃取柱,從而造成藥物流失.萃取柱的質(zhì)量最關(guān)鍵,有的柱子活化時(shí)還沒(méi)有上樣就堵,或者在上樣的過(guò)程中堵得厲害,1～3min還沒(méi)有流1滴,這樣情況下,應(yīng)該將其丟棄,重新做樣。

　　樣品在提取過(guò)程中，50℃減壓干燥室一定注意負(fù)壓不能太高，否則，容易造成藥物隨著蒸氣流失，會(huì)使試樣處理液中磺胺濃度降低，濃度越低信號(hào)越弱，回收率也會(huì)相應(yīng)降低。

　　陽(yáng)性樣品回收率比較實(shí)驗(yàn)：在5.0g豬肉樣品中分別添加5μg/mL磺胺類藥物混標(biāo)溶液100μL,500μL按樣品前處理步驟處理和測(cè)定，濃度相當(dāng)于含0.1mg/kg,0.5mg/kg的磺胺類藥物，測(cè)定結(jié)果顯示，豬肉中的回收率在90.36%～96.50%范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.58%～0.95%范圍之間，回收率高，且相同濃度下回收率穩(wěn)定性好，低濃度的添加要普遍高于高濃度的添加。

　　如圖1、2(圖中1～5分別代表磺胺二甲基嘧啶，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺甲唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺喹啉)所示：磺胺二甲基嘧啶的出峰時(shí)間是5.762左右，磺胺間甲氧啶的出峰時(shí)間是7.553左右，磺胺甲唑的出峰時(shí)間是8.690左右，磺胺二甲氧嘧啶的出峰時(shí)間是16.776左右，磺胺喹啉的出峰時(shí)間是18.005左右。圖1是低濃度0.2μg/mL的色譜圖，圖2是高濃度1.0μg/mL的色譜圖，由圖可知，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰譜圖(圖1)受試劑峰(雜峰)的干擾大，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰譜圖(圖2)則受試劑峰的干擾較小。在做樣品過(guò)程種，由于樣品的藥物含量是未知的，需要配制由低到高梯度的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，以滿足不同含量不同的樣品的計(jì)算，可以根據(jù)樣品含量的多少選擇相應(yīng)的濃度點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)校正，或者繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)在曲線圖上查找，得到樣品相應(yīng)的濃度。多點(diǎn)校正一般情況下確定(5～7個(gè)點(diǎn))，濃度范圍是0.1～20.0μg/mL之間。

　　結(jié)論

　　實(shí)驗(yàn)表明，豬肉經(jīng)乙腈先后兩次得以充分提取，加入正己烷脫脂后濃縮、凈化后再濃縮，用流動(dòng)相定容，采用高效液相色譜法C18色譜柱和紫外檢測(cè)器測(cè)定，一次進(jìn)行5種磺胺類獸藥殘留測(cè)定。此方法操作簡(jiǎn)單，單樣檢測(cè)時(shí)間約30min，樣品的提取也比較簡(jiǎn)單，樣品加標(biāo)回收率在90.36%～96.50%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.58%～0.95%之間，適合動(dòng)物組織中5種磺胺類藥物的大批量檢測(cè)。通過(guò)多年來(lái)經(jīng)過(guò)對(duì)各類動(dòng)物組織檢測(cè)的結(jié)果表明，該方法主要具有回收率高的特點(diǎn)，解決了藥物殘留提取不完全的問(wèn)題，滿足市級(jí)檢測(cè)單位對(duì)動(dòng)物組織中5種磺胺類獸藥殘留日常檢測(cè)需要。