近年來，市場(chǎng)上出售的部分羊肉卷中摻有大量鴨肉的新聞屢被報(bào)道，甚至有老鼠肉的新聞，商家通過摻假賺取非法利潤，“掛羊頭賣狗肉”欺騙消費(fèi)者，侵犯消費(fèi)者合法權(quán)益，這種現(xiàn)象在中國已是行業(yè)內(nèi)默認(rèn)的“潛規(guī)則”。目前有效準(zhǔn)確的摻假檢測(cè)方法十分有限，只有個(gè)別檢測(cè)機(jī)構(gòu)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增這些物種特有的DNA，但這種方法并不能直接檢測(cè)肉類的主要成分—蛋白質(zhì)，而且肉類處理加工過程會(huì)輕易地破壞和去除這些DNA。這樣一來，就算食品樣品中含有大量的鴨或老鼠組織和其他一些污染物也無法被檢測(cè)出來。還有一種補(bǔ)充方法—酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)，但是這種方法一次只能檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)，不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種，反應(yīng)特異性也不好。     肉類來源物種檢測(cè)最大的困難是如何找到特定物種的特異蛋白質(zhì)或肽，由于以上兩種方法特異性并不高，可能會(huì)存在假陽性結(jié)果，所以急需開發(fā)出一種快速、準(zhǔn)確和特異性更高的檢測(cè)方法。
    首先采用高靈敏度、高掃描速度的AB SCIEX Triple TOF^TM 5600質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定各肉類的蛋白質(zhì)，通過比較分析尋找各肉類物種蛋白質(zhì)特異的肽，經(jīng)過blast進(jìn)一步篩查和確認(rèn)，然后再在AB SCIEX QTRAP® 4500系統(tǒng)上利用  MIDAS^TM工作流程建立起多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)假羊肉的方法。主要目的是建立一套簡(jiǎn)單易用的MRM檢測(cè)假肉方法，不再需要復(fù)雜的方法開發(fā)過程，而且該方法可以很方便地將新的需要檢測(cè)物種的MRM離子對(duì)加進(jìn)去，在一個(gè)方法里可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)特征肽和多個(gè)物種。另外QTRAP®質(zhì)譜可以利用MRM觸發(fā)的增強(qiáng)離子掃描方式進(jìn)一步確認(rèn)蛋白質(zhì)/肽序列，從而有效去除假陽性的可能，增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性。最終檢測(cè)方法可以利用純鴨肉或雞肉樣品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而很容易計(jì)算出樣品中摻入假肉的比例和量。所以質(zhì)譜檢測(cè)方法要比PCR、ELISA 或其他非直接檢測(cè)方法更簡(jiǎn)易、更準(zhǔn)確和更可靠。
方法
材料
    本文所用的肉類樣品：鴨肉、雞肉、羊肉、牛肉、豬肉、兔肉，均從市場(chǎng)購買，摻假樣品羊肉卷是從某大型超市購買，大鼠肉來自實(shí)驗(yàn)用大鼠腿部肌肉。
樣品制備
    首先取2g肉樣均質(zhì)，加入液氮研磨成粉狀，然后加入蛋白提取液（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS），離心取0.1mL上清液并轉(zhuǎn)移到超濾管中，加入二硫蘇糖醇在60℃條件下保持60分鐘還原二硫鍵，然后加入碘乙酰胺室溫避光反應(yīng)30分鐘進(jìn)行烷基化，加入200μL50mmol/mL碳酸氫銨溶液，14000g離心20分鐘，重復(fù)3次，最后加入100μL含有胰蛋白酶的50mmol/mL碳酸氫銨溶液震蕩混勻，40℃酶解3小時(shí)。
特征肽的找尋
    采用Eksigent nanoLC-Ultra®液相系統(tǒng)和AB SCIEX Triple TOF^TM 5600質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定各物種肉類蛋白質(zhì)，每個(gè)樣品上樣2μg總蛋白。采用75μm內(nèi)徑柱子30分鐘梯度分析時(shí)間。用Protein Pilot^TM軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，所用數(shù)據(jù)庫是NCBInr全庫，選用了氨基酸替換搜索功能。
    通過詳細(xì)比較在各個(gè)物種肉類鑒定的蛋白質(zhì)和肽列表，找到只在鴨肉或雞肉樣品里鑒定的特異肽，即這些肽可以作為鴨或雞的特異標(biāo)志物，且這些肽對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)必須是幾個(gè)物種里都能鑒定到的，只是肽的氨基酸序列有差別，并且盡量選用高豐度蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的肽。最后將這些特征肽再在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast分析，進(jìn)一步確認(rèn)其特異性，即這些肽的氨基酸序列不能與其他幾個(gè)物種100%匹配。
MIDAS^TM工作流程建立
MRM檢測(cè)方法
    采用Shimadzu 20AD XR液相系統(tǒng)和AB SCIEX QTRAP® 4500質(zhì)譜系統(tǒng)構(gòu)建MIDAS^TM工作流程、建立MRM檢測(cè)方法。每個(gè)肉類樣品取2μg總蛋白，經(jīng)過22分鐘的液相梯度條件分離，其中的A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸的乙腈。色譜柱采用Phenomenex Kinetex 4.6mm×100mm，2.6um，100A反向C18色譜柱，流速0.4mL/min，40℃柱溫。
表 1  MRM檢測(cè)液相分離條件

Time（min）	A（%）	B（%）
1	90	10
15	65	35
16	10	90
18	10	90
18.1	2	10
22	98	10

MIADS^TM工作流程
    質(zhì)譜檢測(cè)是在配有電噴霧電離源（ESI）的AB SCIEX QTRAP®4500質(zhì)譜平臺(tái)上完成的。MRM觸發(fā)EPI方法是基于MIDAS^TM工作流程開發(fā)完成。
    基本思路：首先，利用Skyline軟件構(gòu)建鴨和雞的特征肽的MRM離子對(duì)和QTRAP®的MRM觸發(fā)EPI實(shí)驗(yàn)方法。然后在7個(gè)肉類樣品中逐一進(jìn)行篩選和確認(rèn)，根據(jù)同一個(gè)肽的MRM離子對(duì)的保留時(shí)間和MSMS質(zhì)譜碎片離子與鑒定實(shí)驗(yàn)的匹配性去掉在其他肉類出現(xiàn)的MRM離子對(duì)，保留特異的MRM離子對(duì)，并進(jìn)一步優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù)。
    最終確定的質(zhì)譜方法中，TurboV^TM離子源參數(shù)為：gas1、gas2和氣簾氣為50psi，源溫度設(shè)為550℃，噴霧電壓為5500V。采用Scheduled MRM^TM算法進(jìn)行檢測(cè)：MRM檢測(cè)窗口設(shè)置為30秒，掃描時(shí)間設(shè)置為0.6秒。EPI掃描速度10000Da/s，掃描質(zhì)量范圍：250~1200Da，DP電壓50v，CE能量40±15V。
摻入最低定量檢測(cè)限LLOQ
    將鴨肉和雞肉蛋白樣品按比例稀釋加入到羊肉蛋白樣品中，羊肉蛋白總量維持在2μg，以此確定鴨肉和雞肉摻入羊肉中的最低定量檢測(cè)限。用Multiquant^TM軟件自動(dòng)積分并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算CV值和準(zhǔn)確度。
鴨和雞特征肽找尋
    肉類鑒定的方法開發(fā)最關(guān)鍵的是找尋某一物種特征肽。眾所周知，一些物種親緣關(guān)系比較近，蛋白序列差別很小，比如雞和鴨、羊和牛等。還有一些物種的蛋白數(shù)據(jù)庫非常稀缺，比如鴨和羊，這樣找尋這些物種特征肽存在一定的難度，因此實(shí)驗(yàn)采用Triple TOF^TM質(zhì)譜系統(tǒng)和Protein Pilot^TM軟件先鑒定這些物種肉樣品包含的蛋白質(zhì)，充分利用Triple TOF^TM質(zhì)譜系統(tǒng)強(qiáng)大的蛋白質(zhì)鑒定能力和Protein Pilot^TM軟件優(yōu)越的蛋白同源分析能力和物種分組能力。而且通過檢索NCBInr所有物種的蛋白庫，這樣很容易在Protein Pilot^TM軟件中確定一些物種同源的蛋白質(zhì)和肽，并且比較容易地找到某物種特異的肽，即使鴨或羊的數(shù)據(jù)庫不全，也可以通過Protein Pilot^TM軟件氨基酸替換檢索方式找到鴨的特征肽序列。最后在最全的蛋白數(shù)據(jù)庫NCBI網(wǎng)站做blast分析，進(jìn)一步確認(rèn)這些特征肽的物種特異性，將非特異的肽淘汰掉，保留特異肽。
    筆者從某大型超市里隨機(jī)購買的羊肉卷里就鑒定出了大量的禽類來源蛋白質(zhì)，由于鴨蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫不全，加上鴨和雞親緣關(guān)系比較接近，所以顯示的蛋白來源物種基本是原雞，這已經(jīng)提示這些羊肉卷里確實(shí)摻入了某種禽類肉，但無法確定具體是摻入什么肉。通過尋找的特征構(gòu)建的MRM方法檢測(cè)最終顯示這些羊肉卷里主要摻入了鴨肉而非雞肉，這就表明MRM方法比蛋白鑒定方法結(jié)果特異性更好，所以最終確定開發(fā)MRM檢測(cè)方法。
MIDAS^TM工作流程確認(rèn)特征
MRM離子對(duì)
    AB SCIEX QTRAP®系列質(zhì)譜最大的優(yōu)勢(shì)是將串聯(lián)四級(jí)桿的高選擇性MRM掃描和離子阱高靈敏度的碎片離子掃描即EPI組合在一起，從而可以實(shí)現(xiàn)MIDAS^TM工作流程，這樣MRM峰可以得到二級(jí)圖譜的進(jìn)一步確認(rèn)，有效消除假陽性的MRM峰。比如在用雞的特征MRM方法分析兔肉樣品時(shí)，在15.5分鐘出現(xiàn)很明顯的MRM峰，但其觸發(fā)的二級(jí)圖譜去做圖庫檢索發(fā)現(xiàn)此MRM峰匹配到另外一個(gè)肽并不是設(shè)定的雞的特征肽。這說明單純的MRM峰并不一定能判定兔肉中有雞肉成分，需要MSMS圖譜進(jìn)一步確認(rèn)。
鴨肉和雞肉的最終特征
MRM檢測(cè)方法的確立     通過以上流程可以確定，鴨的特征MRM檢測(cè)方法在純雞肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒有檢測(cè)出相應(yīng)的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測(cè)出強(qiáng)度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。但在超市購買的羊肉卷里檢測(cè)出很強(qiáng)的MRM峰，與在純雞肉里出現(xiàn)的MRM峰一致，證明此羊肉卷確實(shí)是摻入了鴨肉，是假羊肉卷。
    通過以上流程，確定雞的特征MRM檢測(cè)方法在純鴨肉、純羊肉、純牛肉、純豬肉、純兔肉和純大鼠肉樣品中都沒有檢測(cè)出相應(yīng)的MRM峰，在純鴨肉樣品中檢測(cè)出強(qiáng)度很高的MRM峰，證明了該方法的專一性和可靠性。同樣在超市購買的假羊肉卷里沒有檢測(cè)到雞的特征MRM峰，證明此羊肉卷里沒有摻入雞肉。
羊肉中摻入鴨肉和雞肉最低
定量檢測(cè)限
   通過人為方法將鴨肉和雞肉蛋白按比例依次稀釋加入到2μg的羊肉蛋白里，用最終確定的鴨肉特征MRM方法和雞肉特征MRM方法來確定最低定量檢測(cè)限，鴨肉和雞肉蛋白從2μg開始摻入，每個(gè)稀釋重復(fù)3次。最終確定鴨肉最低定量檢測(cè)限可以達(dá)到 4ng，最低摻入比例為0.2%，從4~2000ng呈現(xiàn)良好的定量線性。雞肉最低定量檢測(cè)限達(dá)到20ng，最低摻入比例為1%，從20~2000ng呈現(xiàn)良好的定量線性。定量重現(xiàn)性良好，在最低濃度條件下，CV在5%以內(nèi)。這樣的最低定量檢測(cè)限和最低參入比例完全可以滿足日常的肉商檢測(cè)的需要。并可以非常容易地以此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得假羊肉里摻入鴨肉或雞肉的比例和摻入的絕對(duì)量。
    液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為肉類物種來源檢測(cè)提供了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的方法，本方法的靈敏度可以媲美任何現(xiàn)有的ELISA方法或PCR方法。而且液質(zhì)聯(lián)用的方法可以同時(shí)檢測(cè)多種生物物種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于ELISA每次只能分別檢測(cè)某種生物。使用MIDAS™工作流程可以在定量的同時(shí)，進(jìn)行QTRAP®二級(jí)全掃描獲得定性確認(rèn)信息，與其他檢測(cè)方式相比大大減少了假陽性的概率。
    本文給出了肉類物種來源分析的一種通用流程，即用AB SCIEX TripleTOF^TM系列快速采集質(zhì)譜系統(tǒng)和ProteinPilot^TM軟件鑒定各個(gè)物種蛋白質(zhì)，然后分析找到某些物種的特征肽，再進(jìn)行blast分析篩選確定特征肽，然后轉(zhuǎn)到AB SCIEX QTRAP^?質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行MIDAS^TM流程，確定最終的特征肽MRM檢測(cè)方法。
    本文建立了鴨肉和雞肉物種來源檢測(cè)的MRM方法，實(shí)驗(yàn)表明此方法具有很高的靈敏度、特異性、重現(xiàn)性和極低的線性定量檢測(cè)限，并且在市場(chǎng)上出售的假羊肉卷樣品中得到實(shí)際應(yīng)用，也表明此方法完全可以應(yīng)用在日常的羊肉卷摻入鴨肉或雞肉的實(shí)際檢測(cè)中。最終可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線很容易計(jì)算出在羊肉卷里摻入的鴨肉和雞肉比例和絕對(duì)量。
    本文建立的MRM檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易用，不需要再進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的方法開發(fā)過程，可以直接用來檢測(cè)羊肉中摻入的鴨肉和雞肉，并且該方法的通量高，具有很好的擴(kuò)充性，可以方便加入新的需要監(jiān)測(cè)的物種MRM離子對(duì)，一個(gè)方法里可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種。