□ 簡德威 熊含鴻 鄭悅珊 洪澤淳 陳科(通訊作者) 廣東省食品檢驗所

摘　要：本文的目的是建立準(zhǔn)確、高效的氣相色譜-質(zhì)譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法。樣品經(jīng)正庚烷超聲萃取定容后，采用電子轟擊電離源(EI)、選擇離子監(jiān)控(SIM)模式進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量;對前處理中的萃取溶劑、萃取方法、萃取時間進(jìn)行研究，并對檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。根據(jù)不同空白基質(zhì)的加標(biāo)回收試驗的結(jié)果顯示，本方法前處理最優(yōu)條件為使用正庚烷超聲萃取15min。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1~2.0mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.997;在不同基質(zhì)及不同加標(biāo)濃度下，回收率為82.4%~100.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.74%~3.90%。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在不同基質(zhì)中的檢出限均可達(dá)到0.05mg/kg，定量限達(dá)到0.15mg/kg。故得出結(jié)論，本研究通過對前處理條件的研究和檢測方法的方法學(xué)驗證，建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法，該方法定性效果好、定量準(zhǔn)確，且前處理操作簡便、技術(shù)難度較低。

關(guān)鍵詞：3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩 氣相色譜-質(zhì)譜法 食品 超聲萃取

1 引言

3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩(3-acetyl-2,5-dimethylthiophene，ADP)是一種可以作為咸味香精的食品添加劑，其于2002年開始被用作食品用香料，常用于肉類食品加工中以賦予食品烤堅果味[1]。2013年，歐洲食品安全管理局(EFSA)對ADP進(jìn)行安全評估，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在體內(nèi)和體外實驗均表現(xiàn)出基因毒性，會破壞DNA及細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，可能損害人體健康，作為食品用香料使用存在安全隱患[2]，長期使用該物質(zhì)存在食品安全問題和隱患，易導(dǎo)致食品安全事件(事故)發(fā)生。因此，EFSA將ADP從許可香料中剔除，并嚴(yán)禁ADP作為食用香料投放市場或用于食品[3，4]。同年6月14日，歐盟委員會也通過法規(guī)Regulation(EC)No 545/2013，禁止將ADP作為食品用香料使用。目前，我國仍允許ADP作為食品用合成香料使用，并收錄于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014[5]中。但是，中國香精香料化妝品工業(yè)協(xié)會于2013年8月14日發(fā)布自律文件(香化協(xié)字[2013]62號)，要求香料生產(chǎn)企業(yè)不得生產(chǎn)用作食品用香料的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩，食用香精中不得使用該物質(zhì)[6]。

目前，國內(nèi)對3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。查找相關(guān)文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，對ADP的檢測方法有液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8，9]及氣相色譜三重四級桿質(zhì)譜法[10]等。液相色譜法的優(yōu)點是分離效率高、檢測靈敏度高、應(yīng)用范圍廣，缺點是定性效果差，容易受到雜質(zhì)、基質(zhì)等因素的干擾;氣相色譜-質(zhì)譜法的優(yōu)點是前處理簡單、操作方便、定性效果較好，但在復(fù)雜的基質(zhì)樣品中，背景響應(yīng)較高，致使檢測靈敏度降低;氣相色譜三重四級桿質(zhì)譜法的優(yōu)點是定性更準(zhǔn)確、抗干擾能力強、樣品基質(zhì)背景的響應(yīng)較低、靈敏度也高于單級質(zhì)譜，更適用于復(fù)雜基質(zhì)中微量、痕量物質(zhì)的檢測[11-13]，但氣相色譜三重四級桿質(zhì)譜法操作較復(fù)雜，儀器較昂貴，技術(shù)難度較高。

考慮到食品基質(zhì)復(fù)雜和檢測技術(shù)的難度，采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩可以一定程度地避免受到雜質(zhì)和基質(zhì)的干擾，且定性效果好、定量準(zhǔn)確、操作簡便、技術(shù)難度較低，因此本研究選擇氣相色譜-質(zhì)譜法作為檢測方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器設(shè)備

GCMS-QP2010Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[配電子轟擊(EI)電離源]，日本島津公司;AB204-S電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司;Multifuge X3R離心機(jī)，美國賽默飛世爾公司;KQ-500DE超聲清洗器，中國科橋公司;Vortex Genius 3渦旋混合器，德國IKA公司。

2.1.2 材料與試劑

正庚烷(色譜純)，康科德科技有限公司;正己烷(色譜純)，康科德科技有限公司;乙醇(色譜純)，康科德科技有限公司;0.45μm有機(jī)濾膜，美國PALL公司;3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，上海Aladdin公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1.1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)品20mg(精確至0.0001g)，用正庚烷溶解并定容至10mL，此溶液濃度為2mg/mL。

2.2.1.2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制

將3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(2.2.1.1)用正庚烷稀釋成濃度為20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.1.3 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制

用正庚烷將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(2.2.1.2)稀釋成最終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

2.2.2 前處理方法

稱取1.0g均勻樣品(精確至0.0001g)置于50mL離心管中，加入5mL正庚烷，超聲提取15min，5000r/min離心5min。然后將提取液轉(zhuǎn)至10mL容量瓶，殘渣用3mL正庚烷重復(fù)提取一次，合并所有提取液至10mL容量瓶，用正庚烷定容至10mL，過0.45μm有機(jī)濾膜，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

CP-wax：50m×0.25mm(內(nèi)徑)×0.25μm(膜厚)極性毛細(xì)管色譜柱;載氣：He，純度99.999%，流速1.5mL/min;進(jìn)樣口溫度：220℃;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量：1μL;升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以20℃/min升溫至200℃保持3 min，再以10℃/min升溫至220℃保持5min。

2.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源(EI);電離能量：70eV;接口溫度：225℃;離子源溫度：230℃;溶劑延遲時間：5min;測定方式：選擇離子監(jiān)控(SIM)。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩參考保留時間及定性、定量離子見表1，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的質(zhì)譜圖及色譜圖見圖1、圖2。

圖1  3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩質(zhì)譜圖

圖2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩色譜圖

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理條件的研究

3.1.1 萃取溶劑的研究

日常檢驗檢測中，實驗室大多數(shù)使用的低毒萃取溶劑為正己烷、正庚烷、乙醇、異辛烷、二氯甲烷等。本方法選擇常用的正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑，以超聲萃取方式測試不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，考察3種溶劑的萃取效率，選擇效率最高的溶劑作為萃取試劑，結(jié)果見表2。

從表2的檢驗結(jié)果可以看出，使用正庚烷的萃取效率最高，回收率在88.5%~93.5%;其次是乙醇，回收率在79.3%~5.6%;正己烷的回收率最低，只有58.2%~60.5%。考慮到乙醇和水互溶，而帶入的水分可能會影響質(zhì)譜性能，因此選擇正庚烷作為萃取溶劑。

3.1.2 萃取方法的研究

常用的萃取方法有超聲萃取、渦旋提取、索氏提取等，本方法采用超聲萃取、渦旋提取，使用正庚烷為萃取試劑，測試不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，選取回收率最高的萃取方法作為本方法的最終萃取方法，結(jié)果見表3。

從表3的檢測結(jié)果可以看出，不同基質(zhì)通過超聲萃取的回收率在90.8%~95.3%，均高于渦旋提取的回收率(85.2%~89.9%)，因此選擇超聲萃取作為本方法的萃取方法。

3.1.3 萃取時間的研究

以正庚烷為萃取試劑，通過超聲萃取法，研究萃取1、5、10、15、20、30分鐘后不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同萃取時間段樣品的回收率

從圖3可以看出，隨著萃取時間的增加，回收率結(jié)果呈現(xiàn)遞增趨勢，但萃取時間超過15分鐘后回收率無明顯變化，考慮到檢測方法的效率，故選取15分鐘作為本方法的萃取時間。

3.2 方法學(xué)驗證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與測定，得出本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1~2.0mg/L內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=495019.8X-18840.62，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

3.2.2 方法檢出限與定量限

方法的檢出限以3倍信噪比(S/N)計算，定量限以3倍檢出限計算。通過測定不同基質(zhì)的低加標(biāo)含量，可計算出本方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表4。

從表4結(jié)果可以看出，計算得到不同基質(zhì)的檢出限分別為0.046、0.048、0.050mg/kg，因此將本方法的檢出限定為0.05mg/kg，定量限為0.15mg/kg。

3.2.3 準(zhǔn)確性

通過對不同基質(zhì)加標(biāo)量為0.5mg/kg的含量測定，研究本方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，加標(biāo)量為0.5mg/kg的固體基質(zhì)樣品，重復(fù)測定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%;加標(biāo)量為0.5mg/kg的半固體基質(zhì)樣品，重復(fù)測定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%;加標(biāo)量為0.5mg/kg的液體基質(zhì)樣品，重復(fù)測定6次的平均值為0.49mg/kg，回收率為98.0%，均符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求[14]，說明本方法可準(zhǔn)確定量樣品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量。

3.2.4 重復(fù)性

通過對3種不同基質(zhì)的不同濃度加標(biāo)含量的測定，計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，研究本方法的重復(fù)性，結(jié)果見表6。

從表6的結(jié)果中可以看出，固體基質(zhì)低加標(biāo)(0.3mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在83.6%~89.3%之間，RSD為2.45%;中加標(biāo)(0.6mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在85.2%~91.7%之間，RSD為2.78%;高加標(biāo)(1.0mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在87.1%~93.3%之間，RSD為2.87%。

半固體基質(zhì)低加標(biāo)(0.3mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在82.4%~90.2%，RSD為3.90%;中加標(biāo)(0.6mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在86.1%~91.3%，RSD為2.20%;高加標(biāo)(1.0mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在90.9%~100.8%，RSD為3.57%。

液體基質(zhì)低加標(biāo)(0.3mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在86.2%~94.8%之間，RSD為3.46%;中加標(biāo)(0.6mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在86.7%~91.2%之間，RSD為1.74%;高加標(biāo)(1.0mg/kg)6次重復(fù)測定的回收率在92.1%~101.3%之間，RSD為3.23%。

通過不同基質(zhì)的不同濃度加標(biāo)回收率及RSD可以看出，本方法滿足GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求[14]。

4 結(jié)論

本研究建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法。通過對萃取溶劑、萃取方法、萃取時間的研究，確定了較優(yōu)且操作簡便的前處理條件，并對檢測方法的線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、重復(fù)性進(jìn)行方法學(xué)驗證，確保本方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究建立的氣相色譜-質(zhì)譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法，定性效果好、定量準(zhǔn)確，且前處理操作簡便，技術(shù)難度較低，是對目前相對較少的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測方法的補充，為建立3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或方法提供參考依據(jù)，同時對執(zhí)法部門進(jìn)行食品加工和銷售過程中違規(guī)、違法添加化學(xué)原料行為的監(jiān)管提供技術(shù)支持，避免食品安全事件發(fā)生，從而保障食品行業(yè)健康發(fā)展和人民舌尖上的安全。

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基金項目：廣東省藥品監(jiān)督管理局2019年科技創(chuàng)新項目(2019YDZ36)。