隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對食物營養(yǎng)的需求日益旺盛。乳鐵蛋白因具有抗菌、抗氧化、抗癌、促進腸道發(fā)育、促進鐵吸收，以及調節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，故在乳制品及相關的嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品等生產(chǎn)中均有不同程度的添加。隨著“國家優(yōu)質乳工程”的實施，眾多企業(yè)對巴氏殺菌乳工藝進行改進，從而保留了更多天然活性乳鐵蛋白。然而，我國尚未建立完善的乳制品及相關食品中乳鐵蛋白添加量與保留量的統(tǒng)一檢測標準，導致生產(chǎn)者、監(jiān)管者和消費者無法在同一尺度上進行衡量判別。本文通過對乳制品及相關食品中乳鐵蛋白現(xiàn)有的常用檢測方法進行匯總，對不同檢測方法的適用樣本及檢測性能進行分析，提出了不同乳制品及相關食品中乳鐵蛋白檢測方法的建議，旨在為乳制品及相關食品中乳鐵蛋白檢測的標準化提供思考與建議。
 
1 乳鐵蛋白的檢測需求
乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳動物乳汁中存在的一種天然非血紅素鐵結合糖蛋白，具有強大的生物功能——抗菌、抗氧化、抗癌、促進腸道發(fā)育和鐵吸收，以及調節(jié)免疫系統(tǒng)等。因乳鐵蛋白具有優(yōu)質生物功能，免疫力較低的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨質疏松風險的人群，以及缺鐵性貧血人群均對于乳鐵蛋白的補充有所需求。
以嬰幼兒和兒童為例，現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，牛乳鐵蛋白對嬰幼兒和兒童腹瀉、新生兒壞死性小腸結腸炎、新生兒呼吸道疾病、新生兒敗血癥、兒童幽門螺旋桿菌感染等均有一定的預防和輔助治療作用，且對嬰幼兒貧血具有改善作用，并對嬰幼兒生長發(fā)育有促進作用。
母乳是嬰幼兒獲得乳鐵蛋白的主要來源，而無法正常進行母乳哺育的嬰幼兒和其他人群獲得乳鐵蛋白的主要來源則為其他乳制品及相關食品。因為牛乳鐵蛋白和人乳鐵蛋白的氨基酸序列同源性達69%，且具有相似的生物活性，所以是目前最易獲取的乳鐵蛋白來源之一。但鮮牛乳中的乳鐵蛋白含量僅為0.02~0.2g/L，約為母乳中的乳鐵蛋白含量（0.44~4.4g/L）的1/20，且鮮牛乳中的乳鐵蛋白會隨著加工過程中加熱時間、pH值、鐵飽和度及壓力等因素的變化而降低活性與功能。因此，大部分企業(yè)會在乳制品及相關食品中添加易獲得的牛乳鐵蛋白，其目前已被應用于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品、特殊膳食食品及保健食品中。由于乳鐵蛋白原料價格較高，一些不法企業(yè)少添加或不添加乳鐵蛋白，使產(chǎn)品與宣傳標示的添加量嚴重不符，侵犯了消費者的利益。牛乳鐵蛋白作為生鮮牛乳中的天然成分，更多地保留其天然營養(yǎng)活性也是目前關注的技術重點，“國家優(yōu)質乳工程”明確提出優(yōu)質巴氏殺菌乳生物活性物質的指標要求——乳鐵蛋白≥25mg/L。如此看來，對乳制品及相關食品中乳鐵蛋白進行檢測顯得尤為重要，其不僅能對標示添加量進行控制，還可對巴氏殺菌工藝進行精準控制。
 
2 乳鐵蛋白的常用檢測技術
目前，乳制品及相關食品中的牛乳鐵蛋白檢測尚無國家強制性標準，現(xiàn)有的常用檢測方法按照檢測原理可分為免疫學分析法（免疫擴散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測法）和色譜分析法（高效液相色譜法、高效液相-質譜聯(lián)用法/超高效液相-質譜聯(lián)用法、毛細管電泳法、凝膠電泳檢測方法）。此外，分光光度法、離子共振法、生物傳感測定法、核酸適配體法等也有所報道。
 
2.1免疫學檢測
免疫學檢測是基于抗原抗體特異性反應的檢測方法，已報道的乳鐵蛋白檢測方法有隨機免疫擴散法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測方法等。免疫學檢測的關鍵在于抗體的特異性，即乳鐵蛋白抗體與乳制品及相關食品中其他酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等成分無交叉反應。
2.1.1 免疫擴散法
免疫擴散法以抗原-抗體的免疫沉淀反應為基礎，以瓊脂為惰性載體，通過沉淀帶與乳鐵蛋白標準濃度的關系即可定量測定待測樣品中乳鐵蛋白的含量。
免疫擴散法可用于檢測嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量。該方法成本相對低廉，但操作步驟復雜，檢測耗時大于48h，且檢測結果需通過人為測量沉淀環(huán)直徑進而容易產(chǎn)生誤差，檢測范圍在50~200mg/L之間，故在實際檢測中的應用并不廣泛。
2.1.2 酶聯(lián)免疫法
酶聯(lián)免疫法是在抗原與抗體特異性結合的基礎上通過酶標記及顯色劑判斷最終結果的常用檢測方法。乳鐵蛋白的分子量為70~80kD，因此常采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法進行測定——在酶標微孔上預包被牛乳鐵蛋白抗體，預包被的牛乳鐵蛋白抗體與酶標抗體（酶標物）同時與樣本中的牛乳鐵蛋白結合形成抗體-牛乳鐵蛋白-酶標抗體復合物，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光值與牛乳鐵蛋白的含量呈正相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中牛乳鐵蛋白的含量。
由于抗原與抗體的特異性及酶催化效率，酶聯(lián)免疫方法具有反應靈敏、特異性強的特點。據(jù)報道，對于乳制品及相關食品中乳鐵蛋白的檢測，乳粉檢出限可達20mg/kg，液體乳檢出限可達到0.1mg/kg。目前，酶聯(lián)免疫法商品化試劑盒的研發(fā)技術已相對成熟，故使檢測操作更為簡便，能夠對大量樣本進行檢測，但不同廠家的試劑盒、實驗人員的操作經(jīng)驗和熟練程度等因素對檢測結果的準確度有所影響。由于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品中相關乳制品中乳鐵蛋白的添加量較高，且不同廠家之間差異較大，因此檢測時需將樣本稀釋在試劑盒的線性范圍內，使稀釋倍數(shù)提升2000~4000倍；同時，不同廠家之間的配方也有所不同，其他元素的干擾較多、樣本前處理方法不當?shù)榷紩斐蓹z測結果的差異。為減少誤差，保障檢測結果的準確性，對于同一樣本的檢測需要定期對試劑盒進行質控和回收試驗，建議每次對不同樣品進行檢測時都要進行隨行質控或回收試驗。
2.1.3 免疫層析快速檢測
免疫層析快速檢測法的特點是在抗原與抗體特異性結合的基礎上利用標記技術和層析反應，達到快速、準確檢測待檢物的目的。對于簡單樣本液體乳而言，該方法不需要進行前處理即可對大量樣本中的目標物質進行快速篩查，具有簡便快速的優(yōu)點。乳鐵蛋白免疫層析快速檢測法的檢測限最低可達2.4μg/L，具有靈敏度高的特點，但該方法因存在樣本基質差異問題和假陽性的風險，不適用于其他成分復雜乳制品及相關食品的檢測，也不適用于執(zhí)法機構進行判別確證。因此，應根據(jù)檢測特點選取合適檢測限的免疫層析快速檢測產(chǎn)品用于企業(yè)對巴氏殺菌工藝控制的快速判別。
 
2.2 色譜法檢測
色譜法檢測是利用不同的物質在固定性和流動相兩相間的分配不同，從而達到待測物分離的目的。目前報道的乳鐵蛋白檢測方法有高效液相色譜法、高效液相-質譜聯(lián)用法/超高效液相-質譜聯(lián)用法、毛細管電泳法、凝膠電泳檢測方法等。
2.2.1 高效液相色譜法
高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是利用不同的色譜柱對不同組分因分配系數(shù)及吸附力大小的不同而被分離，并被特定檢測器識別的定量檢測技術。HPLC方法因具有反應靈敏、結果準確、重復性好等優(yōu)點，在眾多乳鐵蛋白檢測方法中已被作為團體標準公布實施，同時也被作為食品中乳鐵蛋白測定的國家標準征求意見稿中的第一法。此方法對于液態(tài)乳樣品的檢測定量限可達到5~20mg/kg，乳粉等固態(tài)樣品的定量限可達到10~100mg/kg。但因受復雜基質所影響，HPLC方法在其他樣本檢測中的定量限不盡相同，如在特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品中的定量限能夠達到150mg/kg。HPLC方法的實際應用并不廣泛，主要原因在于儀器昂貴、操作相對復雜、對實驗人員要求較高等。HPLC操作中復雜度較高的主要環(huán)節(jié)是樣品前處理，因其對樣品純度要求較高，且乳制品及相關食品的基質成分相當復雜，故無法直接進行液相色譜檢測，目前常用肝素親和柱凈化乳制品及相關食品中乳鐵蛋白的檢測，而肝素親和柱的使用又增加了樣品的檢測成本。
2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法
質譜儀通過測量特定離子的質核比來對待測物進行準確定性，并能與高效液相色譜/超高效液相色譜等聯(lián)用來達到精確定量的目的。牛乳鐵蛋白的分子質量為70~80kD，其檢測是將蛋白質組學技術、同位素標記技術與高效液相色譜-質譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法相結合進行，即先利用堿性胰蛋白酶水解牛乳鐵蛋白確定乳鐵蛋白的特異性肽段，并配合穩(wěn)定同位素肽段作為內標，進而實現(xiàn)乳鐵蛋白定量檢測。該類方法抗干擾能力強、靈敏度極高、重復性好，其中，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法的乳鐵蛋白定量限可達5mg/kg，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法的乳鐵蛋白定量限可達0.077~0.137mg/kg。此方法適用于多種樣本中牛乳鐵蛋白的含量測定，同時也能對其他來源的乳鐵蛋白進行準確鑒定。但這一方法的前處理過程需將乳鐵蛋白酶解，而活性與非活性乳鐵蛋白均可參與此過程，致使最終的檢測結果為樣本中乳鐵蛋白的總量，并不能區(qū)分樣本中活性乳鐵蛋白與非活性乳鐵蛋白。此外，該方法使用的設備相比HPLC更加昂貴，對操作人員的專業(yè)性要求也更高，因此適用性并不廣泛。
2.2.3 毛細管電泳法
毛細管電泳法是以毛細管為分離通道、高壓直流電場為驅動力的液相分離技術，也是實驗室常用的分離與檢測蛋白質的手段，該方法操作過程相對簡單，檢測乳鐵蛋白的定量限可達50mg/kg。但是，采用該方法易使乳鐵蛋白被毛細管壁吸附，導致檢測重復性差。通過體系優(yōu)化可以解決此問題，但不適用于乳鐵蛋白含量較低的樣本檢測，僅適用于添加乳鐵蛋白含量較多的食品檢測。
2.2.4 凝膠電泳檢測法
凝膠電泳檢測法是利用不同的DNA探針在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同，從而對目標物進行分離檢測的方法。在乳鐵蛋白檢測領域，選擇一種DNA探針分子與乳鐵蛋白特異性結合，根據(jù)DNA-乳鐵蛋白結合物在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率與條帶的灰度值便可對樣本中乳鐵蛋白進行定量檢測。此方法使樣本中的乳鐵蛋白在高溫條件下與DNA探針進行特異性結合，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，奶粉檢出限可達74mg/kg，生乳等的檢出限可達10mg/L，且無需借助色譜/質譜/光譜等大型儀器，成本低、通量高，但操作相對繁瑣。
 
3 小結
綜上所述，不同檢測方法有著各自的優(yōu)缺點，監(jiān)管者、生產(chǎn)者可根據(jù)樣本類型及檢驗需求選擇合適的檢驗方法，但仍迫切需要建立統(tǒng)一的國家標準，讓不同檢驗方法擁有統(tǒng)一的對比標準。