□ 吳瑩 王銀平 張群 淄博市疾病預防控制中心

摘　要：為了解山東省淄博市市售生食貝類中副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因的攜帶情況，分別于2019年8、9、10月從不同區縣的零售市場采集牡蠣和毛蚶樣品共40份，運用副溶血性弧菌MPN定量法和多重熒光MPN-PCR法對副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因的攜帶情況進行調查。結果顯示，副溶血性弧菌(tlh基因)檢出率為47.50%(19/40)，其中污染量≥110MPN/g的樣品占26.00%(5/19);毒力基因(tdh、trh)陽性15份，攜帶率37.50%(15/40)，其中牡蠣攜帶率為45.00%(9/20)，毛蚶攜帶率為30.00%(6/20)。故得出結論，淄博市市售牡蠣和毛蚶中副溶血性弧菌的污染水平較高，存在一定的食品安全風險。

關鍵詞：副溶血性弧菌 MPN定量法 多重熒光PCR法 毒力基因

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，其普遍存在于海產品中。食用被該菌污染的食品后，人體常會出現腹瀉、嘔吐等胃腸道反應，嚴重者可發生休克[1]。據報道，近年來由副溶血性弧菌引發的食物中毒呈現出明顯的上升趨勢——已超過沙門氏菌位居首位[2]。在沿海省份和地市，由副溶血性弧菌導致的食源性疾病事件占總數的一半以上[3-4]。研究發現，耐熱性直接溶血素(TDH)、TDH相關的溶血素(TRH)與副溶血弧菌致病性密切相關，被認為是其主要毒力因子[5]。因此，本文對2019年山東省淄博市市售生食貝類中副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因攜帶情況進行了分析，以期為科學有效地控制與治療由該菌引發的食物中毒提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2019年8、9、10月選取淄博市張店區、淄川區、周村區、桓臺縣市售的具有生食貝類代表性的牡蠣和毛蚶進行采樣。選取超市、水產市場等作為采樣地點，用隨機抽樣的方法對相關樣品進行采集。采集牡蠣共計20份，毛蚶共計20份，具體樣品采集分布情況見表1。

1.2 儀器和試劑

儀器：拍擊式均質器，BAGMIXER400;恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司GHP-9160;低溫離心機，Thermo MULTIFUGEXIR;核酸提取儀，蘇州天隆科技有限公司;熒光定量PCR儀，美國ABI公司;VITEK 2 Compact生化鑒定儀。

試劑：3%氯化鈉堿性蛋白胨水、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，北京陸橋;弧菌顯色培養基，法國科瑪嘉;氧化酶試劑，bioMerieux，sa;VITEK2革蘭陰性桿菌鑒定卡、副溶血性弧菌(TDH、TRH、TLH)三重核酸檢測試劑盒，深圳生科原。

1.3 方法

依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》(GB 4789.7-2013)進行定量檢測。

1.4 熒光定量PCR

依據《國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》進行多重PCR實驗，以及毒力基因檢測。結果判讀：tlh基因陽性記為副溶血性弧菌陽性，tdh、trh任一基因陽性則應記為致病性副溶血性弧菌陽性。

2 結果

2.1 副溶血性弧菌毒力基因攜帶情況

經多重熒光PCR檢測，40份貝類樣品(20份牡蠣和20份毛蚶)中，副溶血性弧菌(tlh基因)陽性樣品19份，陽性率47.50%(19/40)，其中牡蠣陽性率為50.00%(10/20)，毛蚶陽性率為45.00%(9/20);毒力基因(tdh、trh)陽性15份，攜帶率37.50%(15/40)，其中牡蠣攜帶率為45.00%(9/20)，毛蚶攜帶率為30.00%(6/20)，各毒力基因攜帶情況見表2。

2.2 副溶血性弧菌污染水平分析

結果顯示，在檢出副溶血性弧菌的19份樣品中，污染量≥110MPN/g的樣品占26.00%(5/19)，其中牡蠣3份，毛蚶2份。在攜帶致病性毒力基因的15份樣品中，各毒力基因的污染量及占比見表3。

2.3 不同采樣地點副溶血性弧菌的檢出情況

此次樣品采集選取了淄博市張店區、淄川區、周村區和桓臺縣這4個區縣進行隨機采樣，以張店區檢出率最高，為36.84%(7/19);淄川區次之，為31.58%(6/19);周村區和桓臺縣檢出率均為15.79%(3/19)。

3 討論

現如今，實時熒光PCR方法已廣泛應用于細菌的快速檢測，包括霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌這5種致病性弧菌的多重PCR檢測[6]。多重PCR可同時檢測副溶血性弧菌的種特異基因和毒力基因(tdh和trh)，即在檢出副溶血性弧菌的同時判斷其致病性，具有快捷、高效的特點，目前已被日本、美國等國家的食品檢測機構廣泛應用[7]。由檢測結果可以看出，副溶血性弧菌在淄博市市售牡蠣產品中的檢出率(50.00%)高于毛蚶(45.00%)，毒力基因的攜帶率同樣是牡蠣產品(45.00%)高于毛蚶(30.00%)。究其緣由，可能與牡蠣的濾食性較強有關，它可將致病性弧菌富集在體內達到107~109CFU/mL[8]。從地域分布來看，張店區的檢出率在4個區縣中最高(36.84%)。張店區是淄博市的中心城區，更是全市政治、經濟、文化、金融和科技中心，無論是人口的密集度還是產品的銷售流通量都較其他3個區縣高，這可能是導致張店區檢出率高的原因之一。

傳統的副溶血性弧菌檢驗方法及手段不僅耗時長，且工作量極大，已不能滿足食源性疾病中的快速診斷要求。而熒光PCR方法便捷、快速、自動化強，極大地提高了檢驗效率，已被越來越多的應用于檢驗工作中。將傳統方法與PCR方法相結合，取長補短以提高檢測效率，不僅能夠為副溶血性弧菌的快速診斷和食源性疾病的控制提供參考依據，還可為致病弧菌的流行病學調查提供參考。

參考文獻：

[1] 沙丹，管紅霞，馮微宏，等.無錫市副溶血性弧菌感染的分子流行病學特征分析[J].中國病原生物學雜志，2015(7):630-633.

[2] 鄭文龍，王卓，馬潔，等.副溶血性弧菌病原學和分子流行病學流行特征研究進展[J].疾病監測，2015，30(4):337-341.

[3] Nair G B, Ramamurthy T, Bhattacharya S K, et al. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticus Serotype O3:K6 and Its Serovariants[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2007, 20(1):39.

[4] Pan T M, Wang T K, Lee C L, et al. Food-borne disease outbreaks due to bacteria in Taiwan, 1986 to 1995.[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35(5):1260-1262.

[5] 張沖，高翔，甄博珺，等.副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐藥性分析[J].中國衛生檢驗雜志，2013(4):1015-1018.

[6] 竇勇，寧喜斌.副溶血弧菌間接ELISA快速檢測法的建立[J].食品工業科技，2007(6):205-209.

[7] 劉雪飛，申越，任園園，等.海產品中副溶血性弧菌檢測方法研究進展[J].食品工業科技， 2014，35(5):370-373.

[8] 王琪，滕勇勇，何仕雯，等.多重PCR快速檢測5種重要致病性弧菌[J].中國衛生檢驗雜志，2014(24):3497-3500.

基金項目：山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2017w5562);課題名稱：副溶血性孤菌的致病性及分子學檢測研究。