□ 上海博爾卡國(guó)際貿(mào)易有限公司 供稿

生乳(原料乳)是乳制品的基礎(chǔ)原料，一般情況下，生乳中的微生物主要是一些無(wú)害的細(xì)菌，但在后續(xù)的成品生產(chǎn)過(guò)程仍需經(jīng)殺菌處理。因此，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》(GB 19301-2010)中并沒(méi)有規(guī)定生乳的致病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，僅要求菌落總數(shù)限量≤2×106cfu/mL(g)。

實(shí)際上，監(jiān)控食品中微生物的種類有利于尋找污染源頭，把控產(chǎn)品質(zhì)量。在常見(jiàn)的微生物種類中，芽孢桿菌屬?gòu)V泛存在于牧場(chǎng)環(huán)境和動(dòng)物飼料中，故在生乳中的檢出頻率較高。其中，部分致病菌會(huì)產(chǎn)生非常耐熱的毒素。以蠟樣芽孢桿菌為例，其芽孢需在100℃的高溫下持續(xù)20min以上才能被殺死。同時(shí)，蠟樣芽孢桿菌是條件致病菌，且產(chǎn)生腸毒素的條件較為苛刻，大多數(shù)情況下菌量保持在較高水平，即≥105CFU/mL(g)【《蠟樣芽胞桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》(WS/T82-1996)】，少數(shù)情況下較低菌量也會(huì)引起食物中毒。由于生乳營(yíng)養(yǎng)豐富，且在適宜溫度(28~35℃)下極易使蠟樣芽孢桿菌大量生長(zhǎng)繁殖，因此，將該菌的檢測(cè)納入風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控對(duì)保證乳品安全具有重要意義。

圖1 MYP 培養(yǎng)基上呈微粉紅色的典型菌落

目前，生乳中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)主要有如下兩項(xiàng)難點(diǎn)。

1 MYP平板中的菌落容易蔓延

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》(GB 4789.14-2014)選用甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)培養(yǎng)基，其中的典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)(表示產(chǎn)卵磷脂酶)，經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)后再進(jìn)行鏡檢和生化鑒定。

然而，由于MYP特異性較低，且在檢測(cè)諸如生乳這種微生物種類及含量均較多的樣品時(shí)，卵磷脂酶分解培養(yǎng)基中的卵黃會(huì)產(chǎn)生沉淀帶，容易使菌落之間漫延連接，導(dǎo)致部分非目標(biāo)種類菌發(fā)酵甘露醇將整個(gè)平板“染成”黃色，進(jìn)而難以鑒定和計(jì)數(shù)，致使不能準(zhǔn)確出具檢測(cè)報(bào)告。

圖2 菌落漫延連接且部分種類非目標(biāo)菌發(fā)酵甘露醇將整個(gè)平板“染成”黃色

2 蠟樣芽孢桿菌組(B.cereus group)中其它菌種的干擾

蠟樣芽孢桿菌的生化特征與其同組(蠟樣芽孢桿菌組B.cereus group)的蘇云金桿菌非常相似，參照GB 4789.14-2014中的生化鑒定要求，二者的區(qū)別僅僅是后者在芽孢形成時(shí)能產(chǎn)伴胞晶體，且該伴胞晶體大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，極少數(shù)部分游離。因此，需要延長(zhǎng)菌落在純化平板上的培養(yǎng)時(shí)間(3天以上)，并通過(guò)電子顯微鏡觀察有無(wú)伴胞晶體來(lái)區(qū)分二者;或?qū)⒋郎y(cè)菌落細(xì)胞壁打破，在大量增加游離的伴孢晶體數(shù)量的情況下使用相對(duì)應(yīng)的特異性抗體類產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株加入生乳后在顯色平板上的生長(zhǎng)情況

因?yàn)閱蝹€(gè)典型菌落難以分離，所以容易導(dǎo)致后續(xù)鑒定更加困難。博爾卡(Biokar)的COMPASS® BACILLUS CEREUS顯色培養(yǎng)基可以有效解決上述問(wèn)題——其特殊的選擇性成分可以避免絕大多數(shù)污染菌群的干擾，顯色底物與COMPASS® BACILLUS CERE US瓊脂配方中選擇劑之間的相關(guān)性允許僅在孵育24小時(shí)后直接計(jì)數(shù)特征性菌落，且無(wú)需確認(rèn)。目前，該方法已經(jīng)獲得AFRNOR認(rèn)證。圖3為蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)63303)加入生乳后在顯色平板上的生長(zhǎng)情況(與圖2為同一樣品)，蠟樣芽孢桿菌呈現(xiàn)典型的藍(lán)綠色，白色菌落為非蠟樣芽孢桿菌。此外，鏡檢時(shí)如觀察不到芽孢結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天即可，如圖4。

圖4 鏡檢時(shí)的菌落

為確保COMPASS® BACILLUS CEREUS顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，博爾卡使用41株不同的干擾菌株及41株蠟樣芽孢桿菌組內(nèi)菌株(不同種類或分型)進(jìn)行了驗(yàn)證，并取得了令人滿意的結(jié)果——在克服傳統(tǒng)方法部分劣勢(shì)的同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，證明該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作效率的提升具有十分重要的意義。