于金英，王 津，全奕潔，汪 冶*

(麗水學院，浙江麗水 323000)

摘 要：基于多實驗指標考察優(yōu)化蓮房原花青素超聲波輔助提取工藝。運用正交試驗設(shè)計通過對3個試驗指標包括蓮房原花青素(LSPC)提取率、低聚蓮房原花青素(LSOPC)提取率、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率進行考察優(yōu)化超聲波輔助提取工藝參數(shù)，采用層次分析法(AHP)確立權(quán)重確定優(yōu)化工藝。超聲輔助提取優(yōu)化工藝結(jié)果為乙醇體積為50%，料液比1∶15，提取4次，提取30 min。基于多實驗指標的優(yōu)化工藝能更加客觀地反映蓮房原花青素的提取效果。

關(guān)鍵詞：超聲波輔助提取;原花青素;多指標考察;層次分析法

蓮房(蓮蓬)是蓮的成熟花托，是蓮子收獲過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一般在蓮子采收過程中被丟棄。蓮房與葡萄籽相似，含有大量原花青素成分，原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或兒茶素單體及其聚合體形成的多酚化合物組成的，按照聚合度的不同以及單體的構(gòu)象或鍵合位置的不同可形成多種化合物，一般分為低聚體OPC(聚合度=2～4)和高聚體PPC(聚合度≥5)。聚合體的抗氧化能力隨著聚合度的增大而降低，且低聚體(OPC)較高聚體(PPC)具有良好的生物利用度[1]。為了有效利用蓮房原花青素(Procyanidins Of Lotus Seedpod，LSPC)，本研究利用層次分析法(The Analytic Hierarchy Process，簡稱AHP法)開展多指標優(yōu)選的綜合評價，通過對3個實驗指標：蓮房原花青素(LSPC)提取率、低聚蓮房原花青素(LSOPC)提取率、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率進行綜合評估，可以更加客觀地反映處州白蓮蓮房中蓮原花青素(LSPC)的提取效率和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

處州白蓮蓬購于麗水市蓮都區(qū)老竹鎮(zhèn)處州白蓮種植基地，剝除蓮子，將蓮蓬自然陰干。

1.2 儀器與試劑

SG250H超聲波提取器、HX-5FD真空冷凍干燥設(shè)備。兒茶素標準品(上海源葉生物科技有限公司)、硫酸、香草醛、甲醇、乙醇。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓮房原花青素提取

選用陰干的去除蓮子的干燥蓮房若干，用高速粉碎機粉碎，過24目篩，稱取適量粉末，加入一定量的乙醇，超聲提取，離心過濾得到提取液。提取液經(jīng)過薄層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收酒精后，剩余水溶液進行冷凍干燥處理制備蓮房原花青素(LSPC)樣品。

1.3.2 低聚蓮房原花青素(LSOPC)和高聚蓮房原花青素(LSPPC)樣品制備

利用蓮房原花青素中低聚體和高聚體溶解性差異進行分級分離。將上述制備的蓮房原花青素樣品溶于水，首先采用等體積乙酸乙酯萃取3次富集低聚蓮房原花青素，回收溶劑制備低聚蓮房原花青素(LSOPC)樣品，萃取后的水溶液經(jīng)冷凍干燥制備高聚蓮房原花青素(LSPPC)樣品。

1.3.3 蓮房原花青素含量的測定

(1)兒茶素標準曲線的繪制。準確稱取兒茶素標準品25 mg，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，配制兒茶素標準貯備液1 mg/mL。分別移取兒茶素標準貯備液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容，制備得到濃度為0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL和0.20 mg/mL的兒茶素標準品溶液。分別移取上述不同濃度的溶液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后依次加入2.5 mL的30 g/L香草醛-甲醇溶液和2.5 mL的30%硫酸-甲醇溶液，在30 ℃水浴里避光反應15 min，在波長500 nm處測定吸光值，以兒茶素濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制兒茶素的標準曲線[2]。

(2)蓮房原花青素提取率的計算。取1.3.1和1.3.2項制備的樣品，按照(1)項操作。用70%乙醇作為待測液，在相同條件下，作一組空白對照試驗。利用兒茶素標準曲線的回歸方程計算提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，然后計算蓮房原花青素的提取率。

式中：n 為提取液稀釋倍數(shù);c 為提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL;V 為提取液體積，mL;m為蓮房樣品質(zhì)量g。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)4 個因素，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC提取率(Z)為指標，采用 L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 單因素實驗

原花青素結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，易溶于水、甲醇、乙醇和稀酸等極性溶劑中 [3-4]，因此選擇酒精溶液作為蓮房原花青素的提取劑，采用超聲波輔助進行提取，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC 提取率(Z)為考察指標，分別考察乙醇體積分數(shù)(40%、50%、60%、70% 和 80%)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25和 1︰30)、提取時間(10 min、15 min、20 min、25 min和30 min)、提取次數(shù)(1次、2 次、3 次、4 次和 5 次)等因素對蓮房原花青素提取效果的影響。按照 1.3.1 和 1.3.2 項制備樣品，然后按照(1)項操作，最后按照 1.3.3 中(2)分別計算提取率。

1.3.6 正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定提取工藝影響因素水平。選用乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)4 個因素，以 LSPC 提取率 % (X)、LSOPC 提取率 %(Y)、LSPPC 提取率 %(Z)為指標，采用 L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝。按照多指標權(quán)重分析進行綜合總評分，并進行直觀分析與方差分析。

1.4 AHP法確定指標權(quán)重

1.4.1 建立優(yōu)先矩陣

為了優(yōu)化蓮房原花青素的抗氧化活性部位提取工藝，將LSPC提取率(%)、LSOPC提取率(%)、LSPPC提取率(%)作為權(quán)重指標予以量化，即將3個指標分為3個層次，并確定各指標的優(yōu)先順序為：LSOPC提取率%()>LSPC提取率%()>LSPPC提取率%()，構(gòu)建成對比較的優(yōu)先判斷矩陣，同時賦予各指標相對評分，見表1。

1.4.2 歸一化權(quán)重系數(shù)

1.4.3 一致性比率

CR=CI/RI，作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標，經(jīng)計算一致性比例因子 CR=0.008 9，CR < 0.10即指標比較的優(yōu)先判斷矩陣具有滿意的一致性，所得權(quán)重系數(shù)有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標準曲線

采用1.3.1的方法，繪制出兒茶素的標準曲線如圖1所示。

2.2 蓮房原花青素提取工藝優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同因素對蓮房原花青素(LSPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSPC)的提取率(%)為評價指標，采用單因素實驗方法考察乙醇體積分數(shù)(%)、料液比(g/mL)、提取時間(min)、提取次數(shù)(次)4個不同因素對評價指標的影響，得到結(jié)果如圖2所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)在60%，料液比1︰20，提取時間25 min時蓮房原花青素(LSPC)的提取率較高，提取次數(shù)(3次和4次)差別不明顯，從實際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗優(yōu)化結(jié)果。

2.2.2 不同因素對蓮房原花青素(LSOPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSOPC)的提取率(%)為評價指標，采用單因素實驗方法考察乙醇體積分數(shù)(%)、料液比(g/mL)、提取時間(min)、提取次數(shù)(次)4個不同因素對評價指標的影響，得到結(jié)果如圖3所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)在60%，料液比1︰20，提取時間20 min時蓮房原花青素(LSOPC)的提取率較高，提取次數(shù)(3次、4次、5次)差別不明顯，從實際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗優(yōu)化結(jié)果。

2.2.3 不同因素對蓮房原花青素(LSPPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSPPC)的提取率(%)為評價指標，采用單因素實驗方法考察乙醇體積分數(shù)(%)、料液比(g/mL)、提取時間(min)、提取次數(shù)/(次)4個不同因素對評價指標的影響，得到結(jié)果如圖4所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)在60%，料液比1︰15，提取時間20 min，提取3次時蓮房原花青素(LSPPC)的提取率較高。

2.3 正交優(yōu)化實驗結(jié)果

根據(jù)2.2項的單因素試驗結(jié)果，最終確定提取工藝影響因素水平，見表2。

按照正交試驗 L9(34)進行試驗，分別計算實驗結(jié)果 X、Y 和 Z 值，以 1.4.2 確認的權(quán)重分別計算出 9 組正交試驗綜合評分(M)，總得分(M)=0.539 6Y+0.297 0X+ 0.163 4Z，結(jié)果見表 3。

以綜合評分為標準，對表 3 中數(shù)據(jù)直觀分析表明(表 4)，優(yōu)化提取工藝為 A1B2C3D2，方差分析結(jié)果(表 5)顯示因素 A、B、C、D 對實驗結(jié)果均無顯著影響，最終確認生產(chǎn)工藝為 A1B2C3D2，即加入 50% 乙醇，料液比 1 ︰ 15，超聲提取 4 次，每次 30 min。

2.4 驗證試驗

取蓮房樣品適量，按照優(yōu)化提取工藝進行驗證試驗，分別測定LSPC、LSOPC和LSPPC提取率，結(jié)果見表6。所得工藝簡便、穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論與討論

超聲的機械作用和空化作用可以破壞細胞壁，加強細胞內(nèi)有效成分的傳遞作用，且不會改變小分子化學成分的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，可以加快細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的溶出速度[5]。因此，較一般常規(guī)溶劑加熱提取方式提取時間更短，提取效率更高。

層次分析法(The Analytic Hierarchy Process，簡稱AHP法)是一種解決多目標的復雜問題的定性與定量相結(jié)合的決策分析方法，判斷和衡量目標能否實現(xiàn)的標準之間的相對重要程度，并合理地給出每個決策方案的各標準的權(quán)數(shù)，利用權(quán)數(shù)求出各方案的優(yōu)劣次序[6-7]。

本實驗綜合考慮蓮房中總原花青素(LSPC)、低聚蓮房原花青素(LSOPC)、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率，以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，采用層次分析法、多指標加權(quán)綜合分析法，利用正交設(shè)計優(yōu)選原花青素的提取效率。優(yōu)化后的工藝具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可操作性。