秦俊蓮1,2，徐寧寧2

(1.廣東中測(cè)食品化妝品安全評(píng)價(jià)中心有限公司，廣東中山 528437;

2.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心)，廣東廣州 510070)

摘 要：隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，食品安全質(zhì)量已經(jīng)成為當(dāng)今備受關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題之一。食品微生物檢測(cè)是食品安全與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要技術(shù)手段之一，本文對(duì)食品微生物檢測(cè)的方法進(jìn)行了概述，包括傳統(tǒng)檢測(cè)方法、改進(jìn)后的培養(yǎng)檢測(cè)法、代謝技術(shù)法、生物傳感器法、免疫學(xué)技術(shù)法、分子生物學(xué)方法等，以期為食品微生物監(jiān)測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞：食品安全;食品微生物;檢測(cè)技術(shù);方法

隨著國(guó)際食品經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易的發(fā)展，食品安全問(wèn)題受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。食源性微生物引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)已成為全球性問(wèn)題。國(guó)家食品安全調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年以來(lái)致病微生物導(dǎo)致的食物中毒事件數(shù)量一直多于化學(xué)性危害和有毒動(dòng)植物造成的危害。在病因明確的食源性疾病暴發(fā)事件中，由微生物因素引起的發(fā)病人數(shù)最多，占總數(shù)的43.88%。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，近十年，我國(guó)由食源性病原微生物引起的食品安全事故比例高達(dá)60%以上[1]。食源性疾病逐漸成為當(dāng)今世界最突出的食品安全問(wèn)題，而微生物污染存在于食品的加工、生產(chǎn)和流通等各個(gè)環(huán)節(jié)。微生物檢測(cè)在食品安全評(píng)價(jià)及質(zhì)量監(jiān)控方面發(fā)揮著重要作用，限定食品中微生物存在量的閾值，建立完善的微生物檢測(cè)體系是保障食品安全的重要措施[2]。

食品微生物檢測(cè)主要包括菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌3個(gè)方面的檢測(cè)。檢測(cè)人員對(duì)食品進(jìn)行特殊處理，在特定環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定待測(cè)指標(biāo)。除益生菌以外，一般而言，食品中菌落總數(shù)越多，表示該食品受微生物污染程度越嚴(yán)重，食品安全性越差。大腸菌群包含腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯菌屬，屬于能產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌類，這些細(xì)菌寄居于人或者溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)，可隨大便排出寄主體外，食物受糞便污染的程度用大腸菌群系數(shù)表示。致病菌是指可導(dǎo)致人們產(chǎn)生疾病的細(xì)菌類群，根據(jù)現(xiàn)行有效的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，致病菌主要指腸道致病菌和致病性球菌，主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求食品中致病菌不得檢出。在實(shí)際檢測(cè)工作中，如大腸菌群檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，則該食品受到致病菌污染可能性增加，可進(jìn)行致病菌指標(biāo)檢測(cè)[3]，另外根據(jù)長(zhǎng)期檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)和特定產(chǎn)品類型也可直接進(jìn)行某項(xiàng)致病菌檢測(cè)，如水產(chǎn)品的副溶血性弧菌。根據(jù)檢測(cè)需要，運(yùn)用微生物學(xué)的理論與技術(shù)，檢測(cè)食品中可能存在的微生物的種類、數(shù)量等，以判別食品是否符合國(guó)家食品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程為食品微生物檢測(cè)，其主要方法如下。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)檢測(cè)方法是基于微生物形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特性為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的方法。長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)一直遵循增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學(xué)和生化、血清學(xué)鑒定的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)檢測(cè)方法準(zhǔn)確性和靈敏度較高，但檢測(cè)流程繁雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁重、效率不高等問(wèn)題突出[2]，尤其是部分類別的食品保質(zhì)期短，采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法，嚴(yán)重影響和制約了食品在市場(chǎng)上的銷售及流通。此外，傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)。隨著儀器自動(dòng)化、分子生物學(xué)等分析技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)、應(yīng)用并推廣準(zhǔn)確高效的食品微生物檢測(cè)方法是食品安全檢測(cè)的重要目標(biāo)之一。

2 改進(jìn)后的培養(yǎng)檢測(cè)法

基于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行改良，在培養(yǎng)過(guò)程中加入指示劑、顯色劑、抑菌劑、熒光物質(zhì)等來(lái)完善培養(yǎng)，可提高培養(yǎng)基的特異性增菌或分離效果。對(duì)培養(yǎng)基的使用便利性進(jìn)行升級(jí)改進(jìn)，如快速檢測(cè)紙片、集成化生化鑒定試劑條及儀器自動(dòng)化技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)點(diǎn)。

3 代謝技術(shù)法

在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，可根據(jù)代謝產(chǎn)物變化、生物電阻抗等特征開(kāi)展微生物檢測(cè)工作，達(dá)到食品微生物安全檢測(cè)目的。利用定量細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的熱量變化，以對(duì)微生物定量和定性的技術(shù)稱為微熱量技術(shù)。此外，隨著代謝組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析已被建議作為臨床和食品中致病菌鑒別的替代方法[4]。

4 生物傳感器法

生物傳感是指對(duì)生物活性物的理化性質(zhì)變化產(chǎn)生感應(yīng)，它通過(guò)物理、化學(xué)換能器捕捉目標(biāo)物與敏感元件之間的反應(yīng)，然后將反應(yīng)的程度用不連續(xù)或連續(xù)的數(shù)字電信號(hào)呈現(xiàn)出來(lái)，從而得出目標(biāo)物質(zhì)的濃度。生物傳感器法主要有光學(xué)傳感器、生物發(fā)光傳感器和壓電免疫傳感器三種。光學(xué)傳感器適用于檢測(cè)能產(chǎn)生熒光素的細(xì)菌，但靈敏度不高。生物發(fā)光傳感法特異性好，可區(qū)分活菌體和死菌體，但檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。壓電免疫傳感器有利于進(jìn)行生命體活動(dòng)的研究，因此成為生物傳感器的研究熱點(diǎn)之一。

5 免疫學(xué)技術(shù)法

利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)病原體的催化作用形成免疫球蛋白，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品微生物的免疫學(xué)檢測(cè)。目前，免疫學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌和彎曲桿菌等病原菌。免疫技術(shù)主要包括免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫法和免疫磁珠。免疫層析是根據(jù)免疫抗體-抗原的相互吸附原理設(shè)計(jì)出的一種制備收集或檢測(cè)分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫法是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)，依據(jù)抗原抗體的特異性，并結(jié)合酶的作用，明確微生物的數(shù)量，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多細(xì)菌檢測(cè)。免疫磁珠捕獲法是通過(guò)免疫磁珠對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行針對(duì)性的富集，提高傳統(tǒng)方法的敏感性。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》(GB 4789.1—2016)已將免疫磁珠捕獲法作為檢驗(yàn)大腸桿菌O157:H7的推薦方法。

6 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)成為食品微生物檢測(cè)常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。在食品微生物檢測(cè)技術(shù)中，以具有高度保守的核酸序列為對(duì)象設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，通常為16S rRNA基因的高變異片段，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量或者凝膠電泳聯(lián)合紫外核酸檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增結(jié)果，已到達(dá)最終檢測(cè)食品中是否有某種致病菌的存在。在多種分子生物學(xué)手段中，依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)、定量PCR技術(shù)、基因探針技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均得以廣泛應(yīng)用。此外，還有基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法、NASBA法等也被應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)技術(shù)中。

6.1 DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜技術(shù)是基于改進(jìn)的PCR技術(shù)，將目標(biāo)微生物的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生多條特異性與非特異性的DNA擴(kuò)增片段，而后通過(guò)微生物的特有條帶進(jìn)行區(qū)別鑒定。DNA指紋圖譜技術(shù)主要包括隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)技術(shù)和基因內(nèi)重復(fù)性一致序列(ERIC)擴(kuò)增技術(shù)。

6.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)特異性引物，如樣品中存在與各引物特異性互補(bǔ)的片段，即可同時(shí)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)一次擴(kuò)增檢測(cè)多種致病菌的目的。該方法適用于同時(shí)需要檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)菌的樣品，可大大提高檢測(cè)效率。

6.3 定量PCR檢測(cè)技術(shù)

定量PCR檢測(cè)技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記物的量變化或熒光強(qiáng)度變化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量。應(yīng)用較廣泛的技術(shù)包括內(nèi)標(biāo)定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在PCR反應(yīng)管中加入內(nèi)標(biāo)物，可消除PCR擴(kuò)增過(guò)程中不同反應(yīng)體系間以及標(biāo)本間存在的差異與干擾，因此，選擇合適的標(biāo)記物是內(nèi)標(biāo)定量PCR方法的關(guān)鍵點(diǎn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程的手段，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。RUDI等[5]采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，快速檢測(cè)出了食品樣品中的單核增生李斯特氏菌。此外，其他研究者還利用PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫法相結(jié)合，快速測(cè)定了食品中的大腸桿菌和沙門氏菌。

6.4 基因探針檢測(cè)方法

每一種生物都有獨(dú)特的核酸片段，病原微生物也有其特定DNA片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段可制備出探針。基因探針技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品安全微生物檢測(cè)中，可靈敏、快速、直接的檢測(cè)出樣品中的特定目標(biāo)微生物，而不受其他微生物類群存在的干擾。目前，市面上已有多種商品化的基因探針試劑盒出品，如美國(guó)Gene-Trak公司開(kāi)發(fā)的利用特異的基因探針對(duì)單增李斯特氏菌、沙門氏菌、和大腸桿菌的16S rRNA進(jìn)行檢測(cè)的脫氧核糖核酸雜交篩選比色法試劑盒。

6.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將大量已按檢測(cè)要求制作好的探針固化，通過(guò)一次雜交同時(shí)檢測(cè)多種靶基因的技術(shù)，是目前檢測(cè)食品中有害微生物最有效最高效的手段之一。通過(guò)設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有探針的芯片進(jìn)行雜交，在短時(shí)間內(nèi)即可鑒定出大腸桿菌(3～4 h)、沙門氏菌和葡萄球菌等致病性微生物。KIM等[6]采用比較基因組學(xué)技術(shù)，針對(duì)11種常見(jiàn)的食物源性致病微生物設(shè)計(jì)出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的致病性微生物。

7 展望

隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)方法也越來(lái)越多樣化。食品微生物檢測(cè)技術(shù)將會(huì)向自動(dòng)化、快速化、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的方向不斷發(fā)展。每一種檢測(cè)方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，為提高準(zhǔn)確性，在食品檢測(cè)時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合使用，不斷提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，確保食品在制作、生產(chǎn)、包裝和運(yùn)輸?shù)让總€(gè)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量安全。此外，檢驗(yàn)人員在食品微生物檢測(cè)中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，要加強(qiáng)其對(duì)檢測(cè)技術(shù)、流程和標(biāo)準(zhǔn)的掌握程度，將理論和實(shí)踐緊密結(jié)合，從而獲得精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。

微生物污染存在于食品工業(yè)生產(chǎn)銷售的整個(gè)過(guò)程，微生物種類繁多且容易變異，污染情況和分布規(guī)律復(fù)雜，檢測(cè)技術(shù)相對(duì)落后和控制機(jī)理研究缺乏等諸多原因?yàn)槭称肺⑸餀z測(cè)造成諸多困境。因此，不斷加強(qiáng)我國(guó)食品微生物風(fēng)險(xiǎn)分析能力和微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以減少與發(fā)達(dá)國(guó)家的差距，切實(shí)保障糧食的質(zhì)量安全，維護(hù)人們的根本利益，勢(shì)在必行。建立食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)是保障食品安全的基礎(chǔ)手段之一，此數(shù)據(jù)庫(kù)包括數(shù)據(jù)中心與資源共享平臺(tái)、綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系、綜合評(píng)價(jià)指數(shù)模型和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警模型四大關(guān)鍵平臺(tái)，其中綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系由微生物菌種資源庫(kù)、微生物檢測(cè)項(xiàng)目庫(kù)、微生物檢測(cè)方法庫(kù)、危害物質(zhì)信息庫(kù)、微生物安全國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)庫(kù)構(gòu)成。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)掌握了7大類食品的致病微生物污染率及污染水平，為微生物安全研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和菌種資源，對(duì)我國(guó)建設(shè)高水平、高質(zhì)量的食品安全保障體系具有重要意義。綜上所述，食品安全關(guān)系國(guó)計(jì)民生，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品微生物檢測(cè)方法和體系將不斷完善，廣大科研工作者需要共同努力，不斷改進(jìn)和豐富現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，研發(fā)開(kāi)創(chuàng)新的檢測(cè)方法，為食品安全保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)

[1]吳清平,李玉冬,張菊梅.常見(jiàn)食源性致病菌代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2016,43(3):609-618.

[2]李娜,王一村,高靜靜,等.快速檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品,2021,9(46):162-164.

[3]趙程.食品微生物檢驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)[J].現(xiàn)代食品,2020,15(35):120-122.

[4]吳清平.食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)在包裝飲用水行業(yè)的應(yīng)用[J].飲料工業(yè),2015,18(2):74-77.

[5]RUDI K,NATERSTAD K,DROMTORP S,et al.Detection of viable and dead on gouda-like cheeses by real-time PCR[J].Lett Appl Microbiol,2005,40(4):301-306.

[6]KIM H J,PARK S H,LEE T H,et al.Microarray detection of foodborne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics[J].Biosens Bioelectron,2008,24(2):238-246.