齊春艷，黎欣欣，張 靜，雷 毅

(廣東省食品檢驗(yàn)所(廣東省酒類檢測(cè)中心)，廣東廣州 510000)

摘要：目的：建立一種實(shí)時(shí)直接分析離子源(Direct analysis in real time，DART)結(jié)合四極桿/靜電軌道離子阱高分辨質(zhì)譜法(quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，Q-Orbitrap HRMS)快速篩查保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑。方法：樣品經(jīng)80%乙腈水超聲提取，過(guò)0.22 µm微孔濾膜后用DART-Q-Orbitrap HRMS聯(lián)用儀測(cè)定。DART離子源的電離模式為正模式，樣品傳輸速率為0.20 mm/s，離子化溫度為400 ℃，柵極電壓為400 V。Q-Orbitrap HRMS掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描(Full MS/ddMS2)。結(jié)果：在全掃描模式下測(cè)定目標(biāo)化合物的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)，與理論精密質(zhì)量數(shù)相比，相對(duì)質(zhì)量偏差小于1.89 ppm，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定性;同時(shí)采集二級(jí)質(zhì)譜信息，進(jìn)一步提高定性準(zhǔn)確性。該方法檢出限范圍為0.03～2.50 mg/kg，滿足篩查要求。結(jié)論：該方法具有分析速度快，定性準(zhǔn)確，環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，可作為保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：質(zhì)譜法;保健酒;PED5抑制劑;非法添加

保健酒是以白酒或其他酒類為酒基，選擇有治療作用和滋補(bǔ)性能的中藥或藥食同源物質(zhì)如人參、鹿茸、海馬、海參等，通過(guò)浸泡、浸漬、蒸餾等加工手段制成的飲料酒，具有滋補(bǔ)健體、緩解疲勞、行氣活血等保健作用[1-2]。面對(duì)巨大的市場(chǎng)需求和利益誘惑，一些不法商家為凸顯產(chǎn)品功能，吸引消費(fèi)者，在其產(chǎn)品中非法加入西地那非、伐地那非、育亨賓等PDE5抑制劑(5型磷酸二酯酶抑制劑)，達(dá)到獲取暴利的目的[3]。由于非法添加存在隨意性大，劑量不明確等問(wèn)題，消費(fèi)者若長(zhǎng)期、超量食用可能會(huì)引起心律失常、心肌梗塞、高血壓等不良反應(yīng)，甚至威脅生命安全[4]。

目前，PDE5抑制劑的檢測(cè)方法主要有膠體金免疫層析法(GICA)、薄層色譜法(TLC)、拉曼光譜法、近紅外光譜法(NIRS)、液相色譜法(LC)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等(LC-MS/MS)。其中，GICA法、TLC法、拉曼光譜法、NIRS法往往存在靈敏度低、選擇性差、假陽(yáng)性等問(wèn)題[5]。LC法和LC-MS/MS法因其高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測(cè)方法。這些方法傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖然前處理比較簡(jiǎn)單，但是往往存在分離分析時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)試劑消耗量大，環(huán)境污染大等缺點(diǎn)。

DART-Q-Orbitrap HRMS法是結(jié)合了敞開式常壓電離源和高分辨質(zhì)譜儀兩者優(yōu)勢(shì)的一種檢測(cè)技術(shù)。采用DART離子源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣品無(wú)需冗長(zhǎng)的色譜分離過(guò)程，分析速度快，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定性分析。Q-Orbitrap HRMS結(jié)合了四級(jí)桿的高選擇性和離子阱的高靈敏度、高分辨率的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性。

本研究采用DART-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法具有分析速度快，有機(jī)試劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。此外，通過(guò)一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)各目標(biāo)物的提取離子圖進(jìn)行初步定性，同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得12種PDE5抑制劑的二級(jí)特征質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的精準(zhǔn)定性。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西地那非、紅地那非、偽伐地那非、氨基他達(dá)拉非、育亨賓(純度均≥99.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院);羥基豪莫西地那非、那紅地那非、硫代西地那非(純度均≥99.3%，加拿大TLC標(biāo)準(zhǔn)品公司);硫代艾地那非、伐地那非(純度均≥98.6%，美國(guó)Stanford Chemicals有限公司);他達(dá)拉非(純度為99.2%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);去甲基他達(dá)拉非(純度為99.3%，北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司);乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司);試驗(yàn)用水為一級(jí)水(自制);GHP針式過(guò)濾器(0.22 µm，美國(guó)波爾有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

DART實(shí)時(shí)直接分析離子源(美國(guó)Ion Sense公司);Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);電子分析天平(MS105DU、PL602E，瑞士Mettler Toledo公司);移液器(1～10 µL、10～100 µL、100～1 000 µL，1.0～10 mL，德國(guó)Eppendorf公司);EOAA-HM-01多管渦旋混合器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并定容至刻度，得濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。貯存于2～8 ℃冰箱中。

分別準(zhǔn)確移取10 µL各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用80%乙腈水稀釋并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 儀器條件

DART離子源條件設(shè)置：電離方式為正離子模式;離子化氣體為氦氣，壓力為0.55 MPa;待機(jī)氣體為氮?dú)猓瑝毫?.30 MPa;進(jìn)樣模式為12-Dip-it模式;離子源出口至質(zhì)譜進(jìn)口距離為2.40 cm;樣品傳輸速率為0.20 mm/s;離子化溫度為400 ℃;柵極電壓為400 V。

Exactive條件設(shè)置：電離方式為正離子模式;離子傳輸管溫度為250 ℃;掃描方式為Full MS/ddMS2;一級(jí)掃描范圍：/ 100～1 000;一級(jí)掃描分辨率70 000;AGC target：1e6;Maximum IT：100 ms;二級(jí)掃描分辨率：17 500;AGC target：1e5;Maximum IT：50 ms;NCE：20 eV、40 eV、60 eV。

1.3.3 前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取混勻后的保健酒樣品1 g(精確至0.01 g)于50 mL容量瓶中，加適量80%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲15 min，放冷至室溫，用80%乙腈水定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 µm微孔濾膜，供DART-Q-Orbitrap HRMS檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品傳輸速率

本試驗(yàn)將樣品傳輸速率分別設(shè)置為0.2 mm/s、0.3 mm/s、0.4 mm/s、0.5 mm/s和0.6 mm/s，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。樣品傳輸速率在0.2～0.6 mm/s范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著樣品傳輸速率的增大逐步降低。這是因?yàn)闃悠穫鬏斔俾试酱螅繕?biāo)化合物與離子化氣體接觸越不充分，離子化效率較低，離子響應(yīng)強(qiáng)度也隨之降低。因此，綜合離子響應(yīng)強(qiáng)度、峰形等因素，最終選擇樣品傳輸速率為0.2 mm/s。

2.2 離子化溫度

本試驗(yàn)以50 ℃為步長(zhǎng)，在250～550 ℃范圍內(nèi)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 ℃范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)溫度高于400 ℃后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著離子化溫度的升高而降低。因此，最終選擇400 ℃作為離子化溫度。

2.3 柵極電壓

本試驗(yàn)考察柵極電壓在250～500 V范圍內(nèi)，以50 V為步長(zhǎng)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 V范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而增強(qiáng);當(dāng)柵極電壓大于400 V后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而降低。因此，最終柵極電壓選擇為400 V。

2.4 定性過(guò)程

LC-MS/MS法通常利用保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比等信息進(jìn)行定性，而Q-Orbitrap HRMS測(cè)得的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)即可作為定性的依據(jù)[6]。12種PDE5抑制劑的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)理論值與試測(cè)值之間的相對(duì)質(zhì)量偏差在0.02～1.89 ppm范圍內(nèi)，均小于5.0 ppm，滿足定性需求。本研究同時(shí)采集了二級(jí)特征碎片離子信息，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜信息與二級(jí)特征碎片離子信息相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定性。12種PDE5抑制劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.5 檢出限

通過(guò)在空白保健酒基質(zhì)中添加不同濃度水平的12種PED5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各個(gè)物質(zhì)的檢出限。如表2所示，12種PDE5抑制劑檢出限在0.03～2.50 mg/kg范圍內(nèi)，滿足篩查的需求。

2.6 市售樣品的檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)市售的10批次保健酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)樣，采用一級(jí)提取離子圖和一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)對(duì)樣品中可能添加的12種PDE5抑制劑進(jìn)行初步定性篩查，若出現(xiàn)可疑樣品，結(jié)合二級(jí)特征碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步確證。篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)1批次鹿尾巴酒為西地那非陽(yáng)性樣品。采用國(guó)家現(xiàn)行食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法--BJS 201805 食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定(第一法)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該批次鹿尾巴酒為西地那非陽(yáng)性樣品，含量為681 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究將DART與Q-Orbitrap HRMS兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法無(wú)需色譜分離過(guò)程，分析速度快，有機(jī)試劑消耗量少，綠色環(huán)保。此外，Q-Orbitrap HRMS通過(guò)一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)，同時(shí)以數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得的二級(jí)特征質(zhì)譜信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建了12種PDE5抑制劑質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，此數(shù)據(jù)庫(kù)作為自建數(shù)據(jù)庫(kù)可不斷擴(kuò)充，為實(shí)現(xiàn)保健酒中非法添加化學(xué)藥物的快速篩查和精準(zhǔn)定性提供數(shù)據(jù)支撐。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

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[2]王玉潔,王倩,胡正偉,等.淺析中國(guó)保健酒市場(chǎng)的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2019(11):89-90.

[3]劉子雄,黃景輝,譚貴良,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中78種非法添加化學(xué)藥物[J].現(xiàn)代食品科技,2020,36(12):283-292.

[4]孫健,胡青,張甦,等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中30種非法添加壯陽(yáng)類化合物[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2018,37(4):419-426.

[5]朱燕燕,馬桂娟,龔慧.HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定保健食品中11種壯陽(yáng)類非法添加[J].食品工業(yè),2020,41(1):315-318.

[6]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.BJS 201805食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定[EB/OL].(2018-07-17)[2021-09-24].https://www.doc88.com/p-7877817926821.html.