液相色譜-串聯質譜內標法測定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度評

2021-04-22 16:25:59 來源：食品安全導刊定

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液相色譜-串聯質譜內標法測定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度評定

□ 王靜馬曉靜河北省糧油質量檢測中心

摘　要：采用液相色譜-串聯質譜內標法對全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度進行評定，并依據測量不確定度評定的指導文件建立數學模型，對測量重復性、標準曲線、樣品前處理、儀器設備等不確定度來源進行分析和評定，得出擴展不確定度為0.19mg/kg，（k=2）。通過評定發現，樣品重復性測量、標準溶液配制及樣品前處理是該方法不確定度的主要來源。
關鍵詞：液相色譜-串聯質譜儀內標全麥粉嘔吐毒素不確定度
谷物生長過程中極易受到真菌毒素的污染，這不僅會對糧食產量造成極大影響，還可能給農業經濟帶來巨大損失[1，2]。嘔吐毒素是主要存在于小麥、玉米等糧食及其制品中的真菌毒素，人體食用了被嘔吐毒素污染的食物后，會出現惡心、腹瀉、嘔吐等癥狀[3]。因此，檢測小麥中的嘔吐毒素具有非常重要的意義。液相色譜-串聯質譜儀在食品安全檢測中具有準確度較高、受基質干擾影響小等特點，現已成為檢測嘔吐毒素的主要方法之一[4]。
此外，為了更加準確地表達分析結果，需要引入測量不確定度（以下簡稱“不確定度”），其是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[5，6]。當檢測結果接近臨界值時，不確定度的引入能夠更準確地反映真實結果[7，8]。
本實驗提取全麥粉中嘔吐毒素的過程免去了真菌毒素提取中常用的免疫親和柱凈化處理，提高了提取效率，節省了人工與成本；采用內標法對嘔吐毒素進行測定并評定不確定度，建立了液相色譜-串聯質譜內標法測定全麥粉中嘔吐毒素的不確定度評定方法[9，10]。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
嘔吐毒素（DON）標準儲備液（103±1.2μg/mL），Sigma-alorich；穩定同位素13C15-DON標準溶液（2μg/mL），國家糧食和物資儲備局科學研究院；乙腈（色譜純）迪馬科技；甲酸（質譜級），Sigma；乙酸（色譜級），Fisher；蒸餾水，屈臣氏。

1.2 儀器和設備
QTRAP-5500型液相色譜串聯質譜儀（配有電噴霧離子源），美國AB公司；X1R型高速冷凍離心機，美國熱電公司；PL602-L型分析天平，梅特勒-托利多（上海有限公司）；IKA渦旋混合器，廣州艾卡；QB-212型搖擺式混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JSFM-Ⅱ型糧食水分測試粉碎磨，中儲糧成都糧食儲藏科學研究所。
1.3 實驗方法
1.3.1 標準工作曲線的配制
使用1mL移液槍移取1mL嘔吐毒素標準儲備液于100mL容量瓶中，用初始流動相（乙腈︰水=3︰97）定容，得到嘔吐毒素標準使用液濃度為1030ng/mL，儲存于4℃冰箱。
分別準確移取312.5、625、1250、2500、5000μL嘔吐毒素標準使用液于10mL容量瓶中，加入初始流動相稀釋并定容至刻度，得到標準工作曲線的濃度分別為32.19、64.38、128.75、257.5、515ng/mL。

1.3.2 樣品前處理過程
準確稱取5g（精確到0.01g）試樣置于50mL離心管中，加入20mL提取液（乙腈︰水︰乙酸=70︰29︰1），渦旋混勻后置于搖擺式混勻器中振蕩30min，以6000r/min離心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL離心管中，加入0.5mL水并渦旋混勻，在4℃下以12000r/min離心10min，上清液過0.2μm的聚四氟乙烯濾膜。分別吸取180μL濾液和標準系列工作曲線于含有20μL穩定同位素內標工作液的插管中，渦旋混勻，進行液相色譜-串聯質譜測定。
1.3.3 色譜條件
色譜柱：C18柱（柱長100mm，柱內徑2.1mm，填料粒徑1.7μm）；流速：0.4mL/min；柱溫：35℃；進樣量：2μL。流動相：A相，水（0.1%甲酸）；B相，乙腈（0.1%甲酸）；梯度洗脫。
梯度洗脫程序：0~0.5min，3%B；0.5~1.0min，3%~10%B；1.0~6.0min，10%~90%B；6.0~7.5min，90%B；7.5~7.6min，90%~3%B；7.6~9.0min，3%B。
質譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子掃描；多反應監測（multi-reaction monitor，MRM）模式；離子源溫度：600℃；質譜參數見表1。

2 結果與分析
2.1 數學模型

式中：X為樣品中嘔吐毒素的含量（μg/kg)，ρ為計算得到測定液中嘔吐毒素的質量濃度（ng/mL），V為加入提取液的體積（20mL），f為稀釋液稀釋因子2，m為樣品質量5g。

2.2 不確定度分量的來源分析
根據數學模型及實驗過程，液相色譜-串聯質譜內標法測定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度來源有以下幾個方面：①樣品重復實驗引入的不確定度；②樣品質量稱量引入的不確定度；③標準儲備液自身的不確定度；④標準溶液稀釋、工作曲線配置、標準曲線最小二乘法擬合產生的不確定度；⑤樣品制備、提取及稀釋過程產生的不確定度；⑥液相色譜-串聯質譜儀的不確定度。此外，同位素內標13C15-DON引入的不確定度主要體現在標準工作曲線的配制及樣品的內標溶液的加入，因此可忽略不計。

2.3 不確定度分量的評定及計算
2.3.1 樣品重復實驗引入的不確定度
在重復性測定條件下，對陽性樣品進行6次測定，測定結果見表2。

2.3.3 標準溶液引入的不確定度
2.3.3.1 標準儲備液自身的不確定度

2.3.3.2 工作曲線配制引入的不確定度
工作曲線配制過程的不確定度主要來源于量器自身的誤差，以及溶劑在使用過程中因環境溫度引起的體積變化。依據《常用玻璃量具檢定規程》（JJG 196-2006）及《移液器檢定規程》（JJG 646-2006）的要求，玻璃量器及移液槍對應的最大允許誤差按B類評定，服從矩形分布，；200μL移液槍的最大允許誤差為0.003mL，1mL移液槍的最大允許誤差為0.01mL，工作曲線配制過程中量器引入的不確定度見表3。

實驗室的溫度變化范圍通常為（20±5）℃，考慮到液體的體積膨脹，20℃時純水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃，標準工作曲線用初始流動相定容，其膨脹系數與純水相當——近似于2.1×10-4℃，溫度波動按矩形分布計算，，則標準工作曲線配制過程中的相對標準不確定度可合成為：

2.3.4 標準工作曲線擬合引入的不確定度
采用6個濃度梯度的嘔吐毒素標準工作曲線，分別用液相色譜-串聯質譜內標法重復測定2次，以濃度比為橫坐標，峰面積/內標峰面積比為縱坐標，利用數據處理軟件擬合得到線性回歸方程為yi＝a×xi+b，式中：a為斜率、b為截距，測定結果及數據計算見表4。

則由工作曲線擬合所產生的不確定度計算公式如下：

2.3.5 樣品稀釋過程的不確定度
稀釋過程中使用20mL單標吸量管量取提取液，提取液經提取、離心后，用1mL移液槍吸取0.5mL過濾液，并用0.5mL水稀釋，過濾后進質譜儀測定。依據《常用玻璃量具檢定規程》（JJG 196-2006）的要求，20mL單標吸量管的最大允許為誤差按B類評定，服從矩形分布，k= 。提取液中由于乙酸的加入量為微量，故可忽略溫度波動引起的乙酸體積變化。因此，溫度波動引起提取液的體積變化為（1.2×10-3 ×0.7+2.1×10-4×0.29）×5×20=0.0901mL，按均勻分布計算，

，合成相對標準不確定度分量見表5。

2.3.6 液相色譜-串聯質譜儀的不確定度
由液相色譜-串聯質譜儀校準證書提供的峰面積重復性不確定度為1.1％，k=2，則由儀器引入的相對不確定度為：

3 標準不確定度的合成與擴展
3.1 合成相對標準不確定度
樣品測量重復性、樣品稱量、標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品稀釋、液相色譜-串聯質譜儀等不確定度分量值，見表6。

將各分量合成計算全麥粉中嘔吐毒素的相對合成標準不確定度為：

3.2 合成標準不確定度
全麥粉中嘔吐毒素的含量為2.441mg/kg，相對合成標準不確定度為：U(W)=2.441×0.0393=0.0959mg/kg。

3.3 擴展不確定度
擴展不確定度（U），通過使用包含因子k=2，計算得到：U=U(W)×2=0.0959×2=0.19mg/kg。
全麥粉中嘔吐毒素的含量為（2.441±0.19）mg/kg，k=2。

4 結論
本試驗采用液相色譜-串聯質譜內標法測定全麥粉中的嘔吐毒素，該方法免去了傳統免疫親和柱凈化步驟，減化了樣品前處理過程，通過液相-質譜內標法進行定量，提高了實驗結果的準確性。通過對各個不確定分量的評定及分析可以看出，樣品重復性測量、標準溶液配制及樣品稀釋是該方法不確定度的主要來源，由于采用內標法定量，因此忽略了回收率的不確定度。通過評定實驗過程的不確定度，可以有效地控制關鍵步驟，進而減小樣品檢測過程中的偏差，達到更準確測定樣品結果的目的。

參考文獻：
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[9] 測量不確定度評定與表示（JJF 1059.1-2012）[S].
[10] 常用玻璃量器（JJG 196-2006）[S].

作者簡介：王靜（1982-），女，漢族，工作單位：河北省糧油質量檢測中心，職稱：高級工程師，學歷：碩士，研究方向：糧油質量檢測。